Phương pháp quang phổ là gì? Nghiên cứu khoa học liên quan

Khái niệm và định nghĩa

Phương pháp quang phổ (spectroscopy) là tập hợp các kỹ thuật phân tích dựa trên sự tương tác giữa bức xạ điện từ và vật chất. Khi photon va chạm với nguyên tử hoặc phân tử, chúng có thể bị hấp thụ, phát xạ hoặc tán xạ, tạo ra phổ đặc trưng chứa thông tin về cấu trúc và thành phần của mẫu. Dữ liệu phổ thường được biểu diễn dưới dạng đồ thị cường độ tín hiệu theo bước sóng (λ) hoặc tần số (ν).

Phổ có thể cung cấp thông tin về mức năng lượng, kiểu liên kết hóa học, nhóm chức năng và môi trường hóa học xung quanh nguyên tử. Mỗi kỹ thuật quang phổ khai thác một dải tần số hoặc bước sóng khác nhau, từ vùng tử ngoại (UV) đến vùng vi sóng (microwave), giúp nhà phân tích lựa chọn phương pháp phù hợp với loại mẫu và thông tin cần thu thập.

• Xác định thành phần nguyên tố/phân tử
• Phân tích cấu trúc phân tử và liên kết hóa học
• Định lượng nồng độ trong dung dịch hoặc chất khí
• Đánh giá tính chất vật lý và hóa học của mẫu

Phân loại theo vùng bước sóng

Các phương pháp quang phổ được chia theo dải bước sóng hoặc tần số mà chúng khảo sát. Vùng tử ngoại – khả kiến (UV-Vis) từ 200–800 nm nghiên cứu chuyển electron; vùng hồng ngoại (IR) 4000–400 cm⁻¹ phân tích dao động liên kết; quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) dùng tần số radio để khảo sát hạt nhân; quang phổ khối (MS) phân tích khối lượng ion; quang phổ tia X (XRD, XRF) xác định cấu trúc tinh thể và thành phần nguyên tố.

Sơ đồ phân loại:

• UV-Vis: 200–800 nm, phân tích chuyển electron π→π*, n→π*
• IR (4000–400 cm⁻¹): dao động kéo dài/uốn cong liên kết C–H, C=O, O–H
• NMR: tần số 10–1000 MHz, khảo sát môi trường proton và cacbon
• MS: m/z, xác định công thức phân tử, mảnh ion
• X-ray (XRD/XRF): λ ≈ 0.1 nm, cấu trúc tinh thể và thành phần nguyên tố

Nguyên lý cơ bản

Nguyên lý chung của quang phổ dựa trên mối quan hệ năng lượng photon và tần số được mô tả bởi công thức:

$E = h \\nu$

Trong đó E là năng lượng photon, h là hằng số Planck (6.626×10⁻³⁴ J·s) và \\nu là tần số bức xạ. Khi photon có năng lượng đúng bằng khoảng chênh lệch giữa hai mức năng lượng trong nguyên tử hoặc phân tử, hiện tượng hấp thụ xảy ra và tạo ra đỉnh hấp thụ trên phổ.

Đối với phổ hấp thụ, cường độ tín hiệu giảm khi photon bị mẫu hấp thụ; với phổ phát xạ, cường độ tăng tại bước sóng đặc trưng khi mẫu kích thích phát photon. Phép đo tán xạ Raman dựa trên sự lệch bước sóng của photon sau va chạm không đàn hồi với phân tử, cung cấp thông tin bổ sung về dao động và cấu trúc tinh thể.

Quang phổ	Hiện tượng cơ sở	Phương trình đặc trưng
Hấp thụ	A photon mất năng lượng	$A = \\log_{10}(I_0/I)$
Phát xạ	Mẫu phát photon	$I(\\lambda) \\propto N_2A_{21}$
Tán xạ Raman	Photon lệch bước sóng	$\\Delta E = h(\\nu_0 - \\nu_s)$

Quang phổ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis)

Phổ UV-Vis đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch mẫu khi chiếu qua dải 200–800 nm. Các liên kết π→π* và n→π* trong phân tử hữu cơ hấp thụ mạnh ở vùng UV, còn các ion kim loại chuyển tiếp thường tạo peak ở vùng khả kiến. Độ hấp thụ (A) theo bước sóng cho phép định lượng nồng độ theo định luật Beer–Lambert:

$A = \\epsilon \\; l \\; c$

Trong đó \\epsilon là hệ số tắt ánh sáng mol, l là chiều dài đường đi ánh sáng (cm) và c là nồng độ mẫu (mol/L). Thiết bị UV-Vis hiện đại tích hợp monochromator, detector diode-array và phần mềm hiệu chuẩn tự động, cho phép quét phổ nhanh và phân tích nhiều mẫu liên tiếp.

Ứng dụng phổ UV-Vis:

• Định lượng hợp chất hữu cơ chứa nhóm chức màu
• Phân tích protein và axit nucleic bằng đo absorbance ở 260 nm và 280 nm
• Giám sát phản ứng hóa học theo thời gian thực

Quang phổ hồng ngoại (IR)

Quang phổ hồng ngoại (IR) dựa trên dao động nội phân tử khi mẫu hấp thụ photon ở vùng bước sóng 4000–400 cm⁻¹. Mỗi nhóm chức năng có dải hấp thụ đặc trưng: ví dụ, dao động kéo dài của liên kết –C=O xuất hiện ở khoảng 1700 cm⁻¹, trong khi dao động kéo dài của –OH nằm trong vùng 3200–3600 cm⁻¹. Thiết bị FT-IR (Fourier Transform Infrared) sử dụng biến đổi Fourier để chuyển từ miền thời gian sang miền tần số, giúp thu phổ nhanh và cải thiện tỉ số tín hiệu trên nhiễu.

Quy trình đo phổ IR bao gồm bước chuẩn mẫu (dạng màng mỏng, KBr pellet hoặc ATR), hiệu chuẩn máy với mẫu chuẩn polystyrene, rồi thu dữ liệu phổ. Dữ liệu thu được hiển thị dưới dạng đồ thị độ hấp thụ (A) hoặc độ truyền qua (%) theo số sóng (cm⁻¹), cho phép xác định nhóm chức và so sánh với thư viện phổ chuẩn.

Nhóm chức	Vùng số sóng (cm⁻¹)	Ghi chú
–OH (alcohol)	3200–3600	Rộng, hình chuông
–C=O (carbonyl)	1670–1820	Sắc nét, mạnh
–C–H (aromatic)	3030	Rung động sp² C–H
–C≡N (nitrile)	2210–2260	Đỉnh vừa

Ứng dụng chính của IR gồm xác định nhóm chức trong hợp chất hữu cơ, kiểm soát chất lượng dược phẩm và phân tích polymer. Phổ IR cũng hữu ích trong nghiên cứu biến đổi hóa học, như giám sát sự xuất hiện hoặc mất mát nhóm chức qua các bước phản ứng tổng hợp.

Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Quang phổ NMR khai thác hiện tượng cộng hưởng từ hạt nhân khi mẫu đặt trong từ trường mạnh B₀ và kích thích bằng sóng radio. Tần số cộng hưởng hay tần số Larmor được tính theo:

$\\omega_0 = \\gamma B_0$

Trong đó γ là hệ số từ động (gyromagnetic ratio) của hạt nhân, B₀ là cường độ từ trường. Phổ ¹H-NMR và ¹³C-NMR cung cấp thông tin về môi trường hóa học (chemical shift δ), hệ số tách spin–spin (J coupling) và diện tích đỉnh tương ứng với số proton hoặc cacbon tương ứng.

Các kỹ thuật 2D-NMR như COSY, HSQC và HMBC giúp xác định liên kết giữa các nguyên tử và xác định cấu trúc ba chiều của phân tử hữu cơ phức tạp. Kỹ thuật DOSY (Diffusion-Ordered Spectroscopy) còn cho phép phân biệt các thành phần trong hỗn hợp dựa trên hệ số khuếch tán.

• COSY: xác định tương tác proton–proton
• HSQC: liên kết proton–cacbon trực tiếp
• HMBC: tương tác proton–cacbon gián tiếp (2–3 liên kết)
• DOSY: phân tích khuếch tán phân tử

Ứng dụng NMR bao gồm xác định cấu trúc thuốc mới, kiểm soát độ tinh khiết dược phẩm, nghiên cứu tương tác protein–ligand và khảo sát động học phản ứng. Phổ NMR không phá hủy mẫu và có thể sử dụng mẫu lỏng, dung dịch, gel hoặc rắn trong điều kiện MAS (Magic Angle Spinning).

Quang phổ khối (MS)

Quang phổ khối (MS) phân tích thành phần ion mảnh sinh ra khi mẫu bị ion hóa. Các phương pháp ion hóa phổ biến gồm Electron Impact (EI), Electrospray Ionization (ESI) và Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI). Phổ khối biểu diễn cường độ ion theo tỉ số khối/mang điện tích (m/z), với đỉnh phân tử (molecular ion) cho biết khối lượng phân tử nguyên vẹn.

MS thường được kết hợp với sắc ký khí (GC-MS) hoặc sắc ký lỏng (LC-MS) để phân tích hỗn hợp phức tạp. GC-MS phù hợp với hợp chất dễ bay hơi và nhiệt ổn định, trong khi LC-MS thích hợp với phân tử phân cực, có khối lượng cao và không bền nhiệt.

• Base peak: đỉnh có cường độ cao nhất
• Fragment ions: đỉnh mảnh cung cấp thông tin cấu trúc
• Isotope pattern: xác định thành phần nguyên tố (Cl, Br…)

Ứng dụng MS trong hóa dược, phân tích môi trường và forensic: xác định dư lượng thuốc trừ sâu, phát hiện chất cấm và giám sát độc tố. MS cho độ nhạy cao (pg-ng) và độ chính xác khối lượng (<5 ppm với HRMS), hỗ trợ định lượng bán định lượng và định tính phức hợp.

Phương pháp quang phổ tia X

Quang phổ tia X bao gồm hai kỹ thuật chính: phân tích tán xạ tia X (XRD) và phổ huỳnh quang tia X (XRF). XRD sử dụng hiện tượng tán xạ Bragg, được mô tả bởi:

$n\\lambda = 2d\\sin\\theta$

trong đó n là bội số tán xạ, λ là bước sóng tia X, d là khoảng cách mạng tinh thể và θ là góc tán xạ. Mẫu bột hoặc đơn tinh thể được chiếu tia X; phổ tán xạ thu nhận cường độ theo góc 2θ, cho phép xác định cấu trúc tinh thể, kích thước hạt và ứng suất mạng.

XRF đo cường độ photon phát ra khi electron lớp ngoài lấp đầy chỗ trống ở lớp trong sau ion hóa. Đỉnh huỳnh quang đặc trưng cho mỗi nguyên tố, giúp xác định thành phần nguyên tố và nồng độ từ ppm đến phần trăm khối lượng. XRF không phá hủy mẫu, phù hợp khảo cổ, địa chất và kiểm soát chất lượng vật liệu.

Ứng dụng chính

Phương pháp quang phổ ứng dụng trong nhiều lĩnh vực:

• Sinh học và y sinh: xác định cấu trúc protein, tương tác ligand–protein (NMR, MS).
• Hóa dược: kiểm soát độ tinh khiết, phân tích tạp chất (HPLC-MS, IR).
• Môi trường: đo nồng độ kim loại nặng (XRF), dư lượng thuốc trừ sâu (GC-MS).
• Vật liệu: xác định cấu trúc tinh thể (XRD), nhóm chức polymer (IR).
• Forensics: định danh chất gây nghiện, phân tích dấu vân tay hóa học (MS, UV-Vis).

Kết hợp nhiều kỹ thuật quang phổ cho phép đa thông tin: từ thành phần nguyên tố, cấu trúc phân tử đến tính chất động học và nhiệt động. Ví dụ, phân tích dược phẩm thường kết hợp UV-Vis để định lượng, IR để xác định nhóm chức và LC-MS để xác nhận cấu trúc và kiểm tra tạp chất.

Ưu điểm và hạn chế

Ưu điểm chung của các kỹ thuật quang phổ bao gồm độ nhạy cao, khả năng phân tích không phá hủy (cho nhiều phương pháp), thu thập dữ liệu nhanh và khả năng tự động hóa. Nhiều hệ thống tích hợp phần mềm phân tích phổ, thư viện phổ và mô-đun xử lý dữ liệu lớn (big data) để tối ưu hóa quy trình phân tích.

Hạn chế gồm chi phí đầu tư thiết bị và bảo trì cao, đòi hỏi môi trường đo đạc ổn định (vibrations, nhiệt độ, độ ẩm), và yêu cầu người vận hành có trình độ chuyên môn. Một số phương pháp như MS và NMR cần tiêu thụ mẫu đáng kể và phức tạp trong khâu chuẩn bị mẫu, đặc biệt với mẫu sinh học hoặc ma trận phức tạp.

• Chi phí thiết bị và phụ kiện cao
• Cần mẫu tinh khiết hoặc chuẩn hóa kỹ càng
• Yêu cầu phòng thí nghiệm đạt chuẩn (độ rung, nhiệt độ ổn định)
• Đòi hỏi kiến thức chuyên sâu để giải phổ và hiệu chuẩn

Tài liệu tham khảo

• National Institute of Standards and Technology (NIST). “Spectroscopy.” https://www.nist.gov/pml/spectroscopy
• IUPAC. “Compendium of Analytical Nomenclature.” https://iupac.org
• Griffiths, P. R., & de Haseth, J. A. (2007). Fourier Transform Infrared Spectrometry. Wiley.
• Silverstein, R. M., Webster, F. X., & Kiemle, D. J. (2005). Spectrometric Identification of Organic Compounds. Wiley.
• Claridge, T. D. W. (2016). High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry. Elsevier.
• Gross, J. H. (2011). Mass Spectrometry: A Textbook. Springer.
• Cullity, B. D., & Stock, S. R. (2014). Elements of X-Ray Diffraction. Pearson.